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中国药典微生物技术培训问答会

作者:培养基问答来源:中国培养基网 日期:2019-01-03 09:33
中国药典培训问答会
 
请问:以第五代菌做阳性对照,实验过程中的接种按药典应该也算传代,那是否算是第六代菌呢?  答:依然算第五代(接种的菌株算第5代,培养后算第6代)
其实验结果是算哪一代菌的?  答:见上题
 
药典规定只能传代五次,此次实验结果是否有效?  答:有效
 
现在有无对照菌种可以购买?联络电话?  答:省药检所业务科销售药典规定的标准菌株,为第二代甘油冻存管.
 
菌种发放单应包括什么信息?  答:根据自己工作的需要,大致包括:菌种名称,编号,来源,接收日期,接收人等.
 
如何检查黑曲霉孢子悬浮液孢子含量为50~100个/ml.铜绿假单胞菌单菌如果用甘油冷冻管,也是低温,是否也会影响它的活性?应如何保存?  答:可用玫瑰红钠琼脂培养基或改良马丁琼脂来确定黑曲霉孢子悬浮液.铜绿假单胞菌应使用最终甘油浓度为20%的甘油冻存管保存,保存在-30℃或更低温度,则可保持其活性.若是斜面或营养肉汤,建议室温保存.
日水培养基图片
工作菌株,25℃下可连续使用一周,这里的工作菌株是指原液还是制备好的菌悬液.为何工作菌株不低温存放,而是25℃?  答:首先要说明,所有的操作应按药典要求来操作,这里的工作菌株指原液,工作菌株建议在2-8℃保存,但要注意的是,铜绿假单胞菌的工作菌液不能低温保存,低温会损伤其活性.由于笔误,写成了25℃,请更正为2-8℃.
 
简单方便的厌氧培养方案?  答:硫乙醇酸盐培养基;固体培养基的话可考虑使用一次性厌氧袋.
 
甘油冻存管一定要-30℃吗?0℃以下不可以吗?  答:详见《中国药品检验标准操作规范》2010版341页.我们的甘油冻存管保存在-30℃.
 
三糖铁斜面穿刺会断层,这是为什么?  答:产气菌产气使培养基断层,或培养基本身质量问题.
 
第一代菌种可不可以作为工作菌株使用?  答:我们不这样使用,因为担心菌株没有充分复壮,生化特性可能不典型.
 
制备菌悬液时,要使其在10~100cfu中,应多注意的地方是什么?  答:制定标准化操作规程,减少不同实验者带来的误差,接种量、培养温度和时间应每次一致.
 
铜绿假单胞菌不宜放冰箱内保管,但其营养肉汤液能否放在冰箱保管?  答:详见《中国药品检验标准操作规范》2010版341页.能否放冰箱可自行验证.
 
黑曲霉的存放期如何验证?  答:通过孢子悬液计数和菌落特征,进行验证.
 
标准储备菌株必须进行纯度和特性确认?还是在必要情况下才做?  答:详见《中国药品检验标准操作规范》2010版341页,我们在制备标准贮备菌液前进行纯度和特性确认,最好在使用前再进行纯度和特性确认.
 
铜绿假单胞菌贮存温度应为多少度?  答:一般在10℃以上,甘油冻存管至少在-30℃以下.
 
制备工作菌种进行菌种保藏中的保存期是否要进行验证?  答:可参考2010年版《中国药典》标准操作规程(SOP),应进行验证.
 
验证用菌株可否使用ATCC?  答:如果按中国药典检验的,用CMCC
 
菌种鉴定该如何做?  答:请参考讲义内容.
药典菌悬液制备是要菌种的新鲜培养物接种至培养基中,培养18-24h再进行稀释,制备菌悬液,可否直接使用未过期工作菌种进行稀释来制备菌悬液?  答:按药典要求不行,如要使用,请自己验证.
 
斜面低温保藏法:每一次的菌种传代都需要做菌种纯度鉴定吗?  答:建议制备斜面保存管前进行菌种纯度鉴定,以后的每次传代视具体情况而定.
 
如何比较快速有效判断菌液的浓度?除了可以用“比浊仪”参考,还有什么方法?    答:比浊仪只做辅助参考,还需通过平板计数来最后确认菌液的浓度.
 
曾于中检所中购买过黑曲霉的0代包子悬液,说明书上表示应于-20℃中保存,可保存一年,对于此保存唯独及效期,药企可否同法保存自制的黑曲霉孢子悬液?是否要验证?如何验证?    答:黑曲霉孢子悬液制备请参照2010版药典的相关内容.关于验证在前面的问题中已经回复.
 
菌种纯度确认,怎么确认,需确认哪些项目?    答:请参照2010版药典的相关内容.
 
细菌菌种接入营养肉汤中保存一周,这需要验证吗?  答:建议做验证.
 
菌种斜面最多能保存菌几代?经冰箱保存的斜面菌种是否需复苏二次才能进行菌悬液配制?  答:药典规定,菌种传代不应超过5代.冰箱保存的斜面菌种复苏后即可使用.
 
革兰氏染色的时间一般多长时间,染色时间长了对结果有无影响?  答:详见讲义内容,应严格控制染色时间,否则对结果影响很大.
 
哥伦比亚血琼脂平皿生长的菌落,对氧化酶试验是否有影响?菌悬液的制备过程中,接种菌种新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中,这个新鲜培养物怎么理解,冰箱保存斜
面菌种是新鲜培养物吗?  答:没使用过哥伦比亚血琼脂及相关实验.新鲜培养物指刚培养好的菌株,冰箱保存斜面菌种不算新鲜培养物.
 
菌种鉴定时,一定要根据药典的所有试验做完,才能确认是某种菌株吗?可否省略一些试验?  答:请按药典规定来进行菌种鉴定,具体情况可能还要增加适宜的鉴定试验.
 
工作菌株可在25℃连续使用一周,是指同一代同一管的菌株吗?还是说同一代不同管的菌株?  答:笔误更正,同上一题.
 
若没有比浊仪,用什么方法来确认50~100cfu/ml?特别是孢子?  答:孢子计数建议通过平板计数的方法来确定浓度.
 
工作菌种是否可以使用后再次冷藏使用(斜面保藏法)?  答:请自行掌握.
大肠埃希菌镜检时,有时固定好的菌在染色过程中脱落,请问是什么原因引起这种情况?  答:首先,洗干净拨片,挑菌注意不要太多,待菌固定好后再进行染色.
 
生孢梭菌,菌落培养计数时一定要在厌氧条件下进行吗?  答:是
 
菌悬液怎样在24h内确定其菌落数?请讲解细菌和真菌的方法.  答:平板计数方法.
 
生孢梭菌培养时,怎样做才能使其在厌氧中培养?  答:详见2010版药典
 
菌种的纯度鉴定包括哪些内容?如果是跟省药检所买的3代菌是否就不用做纯度或确认试验?  答:省所现在销售的是第二代的甘油冷冻管,严格来说,请做纯度确认.
 
为什么有时候细菌管会长真菌,而真菌管也会长细菌.  答:原因可能是多方面的,某些细菌适宜在真菌培养基上生长,而某些真菌也能在细菌培养基上生长.比如2010版药典无菌检查法,两种培养基的使用范围已删去,已不是绝对的细菌培养基或真菌培养基.
 
在做方法验证时,黑曲霉菌浓度大于20cfu/皿时,培养5天后菌落蔓延扩散,无法各个区分,如何在药典要求的50~100cfu和实际操作结果中找到平衡?因为菌浓对回收率及操作RSD%影响很多.  答:培养48-72h后,菌落刚形成时,及时点计并做记号,然后每天观察有无新的菌落长出并计数.
 
标准菌黑曲霉在传代前需要先接到改良马丁培养基复苏后,再传代,如果需要,接到改良马丁培养基后培养时间怎么定?  答:2010版药典规定,黑曲霉传代,培养时间为5~7天
有时候在玫瑰红钠琼脂或营养琼脂平板上生长有酵母菌,在酵母菌生长的位置底部产生了一个气泡状的圆形,把底部的琼脂都贡起来了,又或者表面没有任何菌落,而琼脂被贡起来,请问这种圆形气泡是菌吗?在计数时是否也把它算入酵母菌?  答:建议挑取气泡内含物接种至改良马丁琼脂培养基中,若能生长,且为酵母菌的菌落形态,应该可以将其算入酵母菌.
马丁培养基图片
大肠生化实验中的靛基质试验(I)项结果为“+”或者“-”均不影响最终结果的判断,请问该项的意义何在?是否可以取消?  答:反应为+,为典型大肠埃希氏菌,-为非典型大肠埃希菌.关系到最终判断,都是必须的实验,不可取消.
 
生化检查用的鉴定盒是否需要跟培养基一样做适用性检查?如果需要做,应该如何进行?  答:用阳性菌做一次,实验结果相符即可.
 
铜绿假单胞菌用什么方法保存及更活处理方法?  答:建议采用甘油冻存管(终浓度为20%的甘油冻存管),-30℃(或更低温度)保存.
 
工作菌种每代可保存多长时间(斜面低温保藏法)才传下一代?  答:教科书上的保存时间为1-6个月.
 
工作菌株的使用记录(时间、用途、使用者等)是否需要建立台账?  答:是
 
菌株的纯度和特性要多久确认一次,最短时间和最长时间分别是多少?  答:做标准储备菌株之前务必要进行鉴定,其它根据实际情况:如污染、活性下降、储存条件发上改变等.
 
革兰氏染色前,菌落是否要先纯化(接到营养琼脂斜面上)还是直接从选择性培养基上挑起菌落直接染色?  答:要纯化,从选择性培养基挑取单个菌落,最好先接到营养琼脂斜面后,再进行染色.
 
真菌接至改良马丁液体培养基中,培养时间为多长?(白色念珠菌、黑曲霉)  答:见2010版药典.
 
菌种鉴定一定要做到生化鉴定吗?  答:要.可以选择传统的生化试验鉴定,也可选择鉴定仪或鉴定试剂条.请视自身情况而定.
 
是否可按10版药典中抑制控制菌检验判定方法进行?比如金葡菌做甘露醇平板分离,革兰染色,血浆凝固酶为阳性就可以了.  答:金葡这样做可以.其他菌株视具体情况而选择适宜的鉴定试验.
 
请介绍一下,有什么简便的方法灭菌甘油?  答:高压湿热灭菌法
 
黑曲霉孢子悬液贮存期验证怎么做.  答:请参考前面该问题的答复.
 
铜绿假单胞菌琼脂斜面变红,是否会造成菌种变异?如何避免该情况出现?(本菌株于25℃保存)  答:出现这样的情况建议对菌种纯度进行鉴定.实验操作请注意防止污染.
 
沙门菌穿刺于三塘铁琼脂斜面后,由试管底部向上分别出现黄→黑→红,三种颜色,如何解释?  答:请看讲义内容.
 
铜绿假单胞菌菌悬液是否也可在2~8℃保存,24小时内使用?  答:不建议,请自己验证.
 
是否一定要使用CMCC的菌株吗?  答:药典是这样规定的.
 
假如使用ATCC的菌株代替CMCC的可以吗?  答:请按药典规定来进行实验,若是药品检验,请用CMCC菌株.
 
可以用液氮保藏甘油冷冻管吗?可以的话应该怎么操作?  答:可以.具体操作不清楚.我们没有液氮保存罐.
 
贵所有开展支原体检查法这个实验吗?  答:没有
 
制备菌悬液的时候,培养物用的营养肉汤用量是多少?  答:没有具体规定,请自行制定.
 
制备菌悬液的时候怎样保证他是50cfu呢?具体说一下操作方法  答:自行摸索一套方法,固定下来,以后就按该方法做就可以了.
 
请问菌种斜面最好多长时间转接一次?  答:参考上一题.
 
20%甘油v∕v是用水还是用相应培养基做稀释?  答:用相应的培养基.
 
验证或做培养基的适用性检查时,若实际操作制得的菌悬液,经测定计数后不在规定的范围内,如>100cfu,是否应判本次实验无效,应重试?若试菌,真菌生长较慢,不能短期内预算菌数,如何解决?  答:第一个问题,请重试.第二个问题,请注意积累平时实验经验,标准化操作,慢慢摸索稀释的倍数.
 
有时候酵母菌在玫瑰红钠平板上不易观察,是否可用孟加拉琼脂培养基代替来作培养?  答:药品检验请严格按药典规定,若是平时科研,应该可以用孟加拉红琼脂培养基代替.
 
菌种的每一次传代(如3代→4代→5代)都必须做菌种鉴定实验吗?  答:视具体情况而定.
 
如何控制菌液的浓度为50~100cfu/ml?  答:见前面问题的回复.
菌种的传代,营养肉汤或改良马丁0.5ml~0.8ml复苏冻干菌粉→直接涂布于营养琼脂培养基或改良马丁琼脂培养箱→是第一代还是第二代?  答:冻干菌粉为第0代,若冻干菌粉未经过培养,直接涂布到培养基上,为第1代.
 
请教一个有关微生物限度检查的问题,在制备10~100cfu菌液时除了你说的比浊法,比较普遍的就是平板计数法,而其中用到的六种试验菌,细菌用营养琼脂计数,霉菌用玫瑰红钠琼脂平板计数,其它四种菌应用何种培养基计数?  答:不知道此处所说的其他4种指的是什么菌.
 
只用平板计数,结果准确吗?还有没有其他方法制备10~100cfu菌悬液?  答:这是一个很好的课题,若感兴趣,你们可以好好研究一下.
 
什么叫比浊法(黑曲霉)?  答:关于比浊法的定义和原理,请上网查百度百科,上面有详细的讲解.
 
大肠埃希菌检查中,MUG培养基配制后显荧光是什么原因?  答:有可能试管玻璃材质自发荧光,也可能清洗不干净,或培养基本身质量,比如有无发生污染等.
 
请问可用何种培养基或手段鉴定枯草芽孢杆菌?eg:大肠埃希菌用EMB,金黄色葡萄球菌用甘露醇  答:目前尚未有合适的选择性培养来鉴定枯草芽孢杆菌,可选用API或细菌鉴定仪等手段来鉴定.
 
如何制备50~100cfu的悬液?有什么方法可以测定具体浓度?  答:参考上题
 
请问:细菌鉴定仪有哪些用途?能够鉴定沙门菌属下的各种沙门菌么?怎样应用?  答:如有需要,可联系梅里埃的技术支持人员:13503006367霍工.他会详细解答你想问的问题.
黑曲霉菌在2~8℃保存经验证后能否延长使用时间?  答:药典规定在验证过的期限内使用.
 
菌种的保藏可否用液体石蜡保藏?与甘油冷冻保藏有何区别?  答:药典未记载液体石蜡保藏法,部分参考书记载斜面保藏法或半固定保藏法可加灭菌石蜡覆盖.
 
用于验证试验的菌株是否经验证均能承受1000ml冲洗?  答:未验证,请咨询药典会.
传代支原体和其它的菌种一样吗?  答:不清楚
什么叫亚培养?  答:请咨询药典会.
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